В 2025 году журналу
ИСПОЛНИТСЯ
95 ЛЕТ!

ЧИТАЙТЕ
Материалы к юбилею >>>

РУБРИКИ

Творчество
наших читателей

ЧИТАЙТЕ
Автор С.И. КАЛИНИЧЕНКО
ГИМН СВИНЬЕ >>>

DOI: 10.37925/0039-713X-2025-6-51-55
УДК 636.4
ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕМАГГЛЮТИНИРУЮЩЕГО ВИРУСА ЭНЦЕФАЛОМИЕЛИТА СВИНЕЙ В РОССИИ

Т.Д. МУСАЕВА¹, мл. научный сотрудник лаборатории молекулярной вирусологии, Е.Б. ШАЙТАРОВА¹, студентка, Н.Д. ЁЛШИН¹, научный сотрудник лаборатории молекулярной вирусологии, Д.М. ДАНИЛЕНКО¹, кандидат биологических наук, заместитель директора по научной работе, Е.В. СТОЛБОВ², кандидат ветеринарных наук, член экспертно-консультационного совета по ветеринарии, В.В. ПРУГЛО², кандидат ветеринарных наук, член экспертно-консультационного совета по ветеринарии при НСС, Д.А. ЛИОЗНОВ¹, доктор медицинских наук, директор А.Б. КОМИССАРОВ¹, заведующий лабораторией молекулярной вирусологии e-mail: a.b.komissarov@gmail.com, ¹ФГБУ «НИИ гриппа имени А.А. Смородинцева» Минздрава России (Санкт-Петербург), ²экспертно-консультационный совет по ветеринарии при Национальном Союзе Cвиноводов

Коронавирусы свиней (SCoV) ‒ группа коронавирусов родов Alphacoronavirus, Betacoronavirus и Deltacoronavirus, включающая несколько опасных и широко распространенных инфекционных агентов (патогенов), вызывающих экономически значимые болезни свиней. Вирус гемагглютинирующего энцефаломиелита свиней (PHEV) относится к бетакоронавирусам и может представлять угрозу для свиней, особенно для поросят периодов подсоса и доращивания.

В данном исследовании впервые в РФ проведено секвенирование PHEV, произведен комплексный анализ циркулирующих штаммов PHEV в европейской части России, включая их молекулярно-генетические характеристики и филогенетические взаимоотношения.

Ключевые слова: свиноводство, гемагглютинирующий вирус энцефаломиелита свиней, PHEV, Betacoronavirus, S-белок.

Identification and genetic characterization of porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus in Russia

T.D. MUSAEVA¹, junior researcher of the laboratory of molecular virology, E.B. SHAITAROVA¹, student, N.D. YOLSHIN¹, researcher of the laboratory of molecular virology, D.M. DANILENKO¹, candidate of biological sciences, deputy director for research, E.V. STOLBOV², candidate of veterinary sciences, V.V. PRUGLO², candidate of veterinary sciences, D.A. LIOZNOV¹, doctor of medicine sciences, professor, director, A.V. KOMISSAROV¹, head of the laboratory of molecular virology, e-mail: a.b.komissarov@gmail.com, ¹Smorodintsev Research Institute of Influenza, Ministry of Health of the Russian Federation (St. Petersburg), ²Expert Advisory Council on Veterinary Medicine, National Union of Swine Producers

Swine coronaviruses (SCoVs), comprising members of the genera Alphacoronavirus, Betacoronavirus, and Deltacoronavirus, include several important pathogens responsible for economically significant diseases in pigs. Among them, porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus (PHEV), a betacoronavirus, represents a potential threat to swine health, particularly in suckling and weaned piglets.

In this study, we report the first sequencing of PHEV in Russia and present a comprehensive analysis of circulating strains in the European part of the country, including their molecular genetic characteristics and phylogenetic relationships.

Key words: pig-breeding, porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus, PHEV, Betacoronavirus, spike protein.

Введение

Коронавирусы (CoV) относятся к семейству Coronaviridae, отряду Nidovirales, имеют (+)РНК-цепь и геном протяженностью около 30 тыс. п.о. Коронавирусы вызывают инфекции респираторного, пищеварительного тракта и нервной системы у млекопитающих и птиц. Способность к рекомбинации геномов и высокая изменчивость позволяют коронавирусам успешно пересекать межвидовые барьеры и адаптироваться к новым хозяевам и экологическим нишам. Их распространенность в природе очень высока [1]. На сегодняшний день, согласно классификации Международного комитета по таксономии вирусов, выделяют четыре рода CoV:

▪ Alphacoronavirus;

▪ Betacoronavirus;

▪ Gammacoronavirus;

▪ Deltacoronavirus.

Среди этих родов выявлено шесть различных коронавирусов, инфицирующих свиней, в том числе четыре, принадлежащие к роду Alphacoronavirus: коронавирус трансмиссивного гастроэнтерита (TGEV), респираторный коронавирус свиней (PRCV), вирус эпидемической диареи свиней (PEDV) и коронавирус острого синдрома диареи свиней (SADS-CoV), один ‒ к роду Betacoronavirus ‒ вирус гемагглютинирующего энцефаломиелита свиней (PHEV) и один ‒ к роду Deltacoronavirus – дельтакоронавирус свиней (PDCoV) [2].

При этом TGEV, PRCV и PHEV выявляют у свиней уже в течение нескольких десятков лет, в то время как PEDV, PDCoV и SADS-CoV считаются эволюционно новыми патогенами. Кроме того, в Италии, Германии, Словакии и Испании были обнаружены химерные штаммы TGEV и PEDV [3‒6].

Геном бетакоронавирусов кодирует 16 неструктурных белков (NSP1‒NSP16) и пять структурных белков. К структурным белкам относятся мембранный белок (M), гемагглютинин-эстераза (HE), шиповидный белок (S), а также белки оболочки (E) и нуклеокапсида (N).

Наибольший интерес вызывает поверхностный гликопротеин S, который состоит из двух субъединиц S1 и S2. Субъединица S1 играет первостепенную роль в связывании вируса с клеточными рецепторами, процесс осуществляется за счет рецептор-связывающего домена (RBD). Субъединица S2 участвует в проникновении вируса в клетку организма хозяина.

В эволюционном плане поверхностный гликопротеин S является наименее консервативным из всех вирусных белков. Рецептор-связывающий домен считается наиболее чувствительным к точечным мутациям участком S-белка, накопление замен в RBD может способствовать межвидовому переходу и адаптации вируса к новому хозяину. Более того, замены в рецептор-связывающем сайте определяют широкий тканевой тропизм многих бетакоронавирусов. Так, вирус гемагглютинирующего энцефаломиелита свиней способен связываться с дипептидилпептидазами ‒ DPP4 и DPEP1, экспрессирующимися в клетках почек и желудочно-кишечного тракта, и с сиаловыми кислотами (Neu5,9Ac2). Такое разнообразие рецепторов у вируса гемагглютинирующего энцефаломиелита свиней может обуславливать разные клинические проявления инфекции [7‒10].

Вирус гемагглютинирующего энцефаломиелита свиней впервые был выделен из тканей мозга поросят с энцефаломиелитом в Онтарио (Канада) в 1962 году группой ученых под руководством A.S. Greig [11]. Позже, в 1973 году, в Бельгии среди свиней был обнаружен вариант PHEV с иными клиническими проявлениями ‒ рвотой, отсутствием аппетита и истощением [12]. В настоящее время известно, что инфекция распространена по всему миру, но поросята защищены колостральным иммунитетом. Смертность среди серонегативных поросят может достигать 100% [13].

В 2015 году в штате Мичиган (США) на фермах были зафиксированы вспышки респираторной инфекции неясной этиологии. Изначальное предположение о гриппе А оказалось ложным: в исследуемых образцах был выявлен вирус гемагглютинирующего энцефаломиелита свиней, впервые ассоциированный с респираторной инфекцией [14].

Респираторный вариант вируса встречается во всех возрастных группах свиней. У взрослых особей болезнь носит субклинический характер; у поросят же сопровождается выделением слизи из носа, кашлем и чиханием. В отличие от вариантов PHEV, сопровождающихся энцефаломиелитом или истощением, респираторный вариант не вызывает высокую смертность среди серонегативных поросят.

В Евразии крупная вспышка респираторного варианта вируса гемагглютинирующего энцефаломиелита свиней была зафиксирована в Китае, в провинции Фуцзянь, в апреле 2021 года. Молекулярно-генетический анализ вирусов этой вспышки показал, что для респираторного варианта PHEV характерна делеция гена NS2, являющегося уникальным для подродов Embeco- и Merbecoviruses рода Betacoronavirus. Ген NS2 кодирует 2',5'-фосфодиэстеразу, которая является антагонистом ряда сигнальных путей внутриклеточного противовирусного ответа [10].

Распространение вируса гемагглютинирующего энцефаломиелита свиней в первую очередь является значимой угрозой для поросят, рожденных от неиммунных свиноматок. Одна из вспышек PHEV с наибольшей смертностью была зафиксирована на свиноферме в Аргентине. По полученным данным, смертность среди поросят составила 16,9% [15].

Приведенные данные свидетельствуют о том, что распространение вируса гемагглютинирующего энцефаломиелита на фермах и промышленных свинокомплексах ведет к существенным экономическим потерям. Понимание эпидемиологии этого возбудителя на территории Российской Федерации, развитие методов диагностики и профилактики данной инфекции будет способствовать сохранению промышленного поголовья.

Материалы и методы

В работе было проанализировано 877 проб биоматериала, собранных в 2024 году от свиней с предприятий европейской части России, на наличие PHEV методом ПЦР в реальном времени.

Экстракцию нуклеиновой кислоты проводили с помощью набора NAmagp2000 («Биолабмикс», Россия), «МагноПрайм ФАСТ-Р» с использованием автоматических станций Auto-Pure 96 (Allsheng). Детекцию нуклеиновой кислоты бетакоронавирусов производили посредством праймеров и зондов Центра по контролю и профилактике заболеваний США. Для ПЦР в реальном времени применяли набор «БиоМастер ОТ-ПЦР-РВ» («Биолабмикс»). Дизайн праймерной панели для полногеномной амплификации (WGA) осуществляли с помощью веб-инструмента PrimalScheme. Амплификацию проводили с использованием реагентов «БиоМастер ОТ-ПЦР-Премиум (2×)» («Биолабмикс»).

Для подготовки библиотек для секвенирования нового поколения применяли набор реагентов MGIEasy Fast PCR-Free FS Library Prep Set (MGI Tech, Китай). Секвенирование проводили на приборе DNBSEQ-G400 (MGI Tech) с использованием наборов DNBSEQ-G400RS High-throughput Sequencing Set FCL SE100.

Прочтения были выравнены на референсную последовательность с помощью программы BWA-MEM2 и Samtools. Консенcусную последовательность получали с помощью программы Unipro UGENE v45. Для выравнивания нуклеотидных последовательностей применяли алгоритм MAFFT. Филогенетический анализ полногеномных последовательностей был выполнен с использованием метода максимального правдоподобия (maximum likelihood, ML) в программе MEGA7 со следующими параметрами: 500 бутстреп-репликаций для оценки поддержки узлов и моделью GTR+G+I. Для анализа последовательностей S-гена филогенетическое дерево было построено методом максимального правдоподобия (ML) с применением обобщенной модели GTR+G с использованием программы RAxML. Полученные деревья визуализировали и аннотировали с помощью инструментов FigTree, TreeSub и Inkscape. Прогноз сайтов гликозилирования осуществляли посредством веб-ресурсов NetNGlyc, NetOGlyc.

Результаты и обсуждение

Первичный скрининг 877 назальных смывов свиней методом ПЦР в реальном времени выявил 137 образцов (15%), положительных на Betacoronavirus. Для трех образцов была проведена полногеномная амплификация и секвенирование.

Сравнение полученных нуклеотидных последовательностей с геномами PHEV из базы данных GenBank позволило установить, что отсеквенированные образцы относятся к новому респираторному варианту гемагглютинирующего вируса энцефаломиелита (rvPHEV) и имеют наибольшее родство с изолятами из Бельгии (рис. 1). Согласно литературным данным, в настоящий момент принято выделять два генотипа rvPHEV – L1, L2, однако вирусы, секвенированные из России, формируют отдельный генотип.

Рис. 1. Филогенетическое дерево, основанное на анализе последовательностей полных геномов вирусов PHEV

Примечание: российские вирусы обозначены красным цветом.

Характерной особенностью rvPHEV является полная делеция гена NS2 или наличие преждевременного стоп-кодона, что приводит к потере способности экспрессировать функциональный белок. Это согласуется с полученными полногеномными последовательностями из России, в которых NS2 также отсутствует.

Анализ аминокислотной последовательности S-белка российских вариантов PHEV с помощью NetGlyc позволил предсказать шесть потенциальных сайтов N-гликозилирования и два сайта O-гликозилирования.

В рецептор-связывающем сайте S-белка выявлен ряд мутаций: F366L, V468I, Q568E (рис. 2). Функциональное значение данных замен неизвестно и требует экспериментального исследования, однако потенциально замены в RDB могут оказывать влияние на аффинность к рецептору, тканевой тропизм и межвидовую передачу.

Рис. 2. Схематическое изображение строения S-белка с указанием замен в рецептор-связывающем мотиве, характерных для российских вирусов

Филогенетический анализ S-гена вирусов PHEV выявил наибольшее родство с современным штаммом, циркулирующем в Бельгии (рис. 3).

Рис. 3. Филогенетическое дерево вирусов PHEV, построенное по последовательностям S-гена, предоставленным GenBank (101 шт.)

Примечание: красным цветом отмечены российские вирусы.

Вирусы из России имеют целый ряд характерных замен, распределенных по всему шиповидному белку: S11A, I118V, I171T, V229A, A273S, F366L, V468I, Q568E, S11A, I118V, I171T, V229A, A273S, F366L, V468I, Q568E, за счет чего и образуют отдельную группу на филогенетическом дереве. Внутри клайда вирусы разделены на две группы по наличию замены P93S. Примечательно, что эта замена характерна для вирусов 2025 года и отсутствует у представителя 2024 года. Дальнейшее расширение исследований позволит дать более четкую оценку формированию отдельного генотипа российскими изолятами.

Выводы

Проведенное исследование впервые выявило циркуляцию нового респираторного варианта вируса гемагглютинирующего энцефаломиелита свиней (rvPHEV) в популяции свиней европейской части России.

Полногеномный анализ показал, что российские изоляты обладают характерной для респираторных штаммов делецией гена NS2.

К ключевым особенностям выявленных российских штаммов PHEV следуют отнести наличие специфических замен в рецептор-связывающем домене (F366L, V468I, Q568E), которые потенциально могут влиять на стабильность белка и его аффинность к рецепторам, формирование отдельной генетической линии с характерными заменами (S11A, I118V, I171T и др.), что свидетельствует об активной эволюции вируса в регионе.

Полученные данные подчеркивают необходимость продолжения мониторинга эволюции PHEV в России, особенно с учетом экономического бремени, наносимого распространением вируса промышленному свиноводству, а также сохраняющихся рисков возможной межвидовой передачи. Выявленные генетические особенности российских штаммов требуют дальнейшего изучения их функционального значения для вирулентности и патогенности вируса.

Литература

1. Thakor J.C., Dinesh M., Manikandan R., Bindu S., Sahoo M., Sahoo D., Dhawan M., Pandey M.K., Tiwari R., Emran T.B., Dhama K., Chaicumpa W. Swine coronaviruses (SCoVs) and their emerging threats to swine population, inter-species transmission, exploring the susceptibility of pigs for SARS-CoV-2 and zoonotic concerns. The Veterinary Quarterly, 2022. Vol. 42. №1. P. 125–147. DOI: https://doi.org/10.1080/01652176.2022.2079756.
2. Jongkaewwattana A., Piñeyro P.E., Giménez-Lirola L.G., Mora-Díaz J.C., Houston E., Zimmerman J. Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus: A review. Frontiers in Veterinary Science, 2019. Vol. 6. P. 53. DOI: https://doi.org/10.3389/fvets.2019.00053.
3. Boniotti M.B., Papetti A., Lavazza A., Alborali G., Sozzi E., Chiapponi C., Faccini S., Bonilauri P., Cordioli P., Marthaler D. Porcine epidemic diarrhea virus and discovery of a recombinant swine enteric coronavirus, Italy. Emerging Infectious Diseases, 2016. Vol. 22. №1. P. 83–87. DOI: https://doi.org/10.3201/eid2201.150544.
4. Akimkin V., Beer M., Blome S., Hanke D., Höper D., Jenckel M., Pohlmann A. New chimeric porcine coronavirus in swine feces, Germany, 2012. Emerging Infectious Diseases, 2016. Vol. 22. №7. DOI: https://doi.org/10.3201/eid2207.160179.
5. Mandelik R., Sarvas M., Jackova A., Salamunova S., Novotny J., Vilcek S. First outbreak with chimeric swine enteric coronavirus (SeCoV) on pig farms in Slovakia – Lessons to learn. Acta Veterinaria Hungarica, 2018. Vol. 66. №3. P. 488–492. DOI: https://doi.org/10.1556/004.2018.043.
6. De Nova P.J.G. et al. A retrospective study of porcine epidemic diarrhoea virus (PEDV) reveals the presence of swine enteric coronavirus (SeCoV) since 1993 and the recent introduction of a recombinant PEDV-SeCoV in Spain. Transboundary and Emerging Diseases, 2020. Vol. 67. №6. P. 2911–2922. DOI: https://doi.org/10.1111/tbed.13666.
7. Shi J., Hu S., Wei H., Zhang L., Lan Y., Guan J., Zhao K., Gao F., He W., Li Z. Dipeptidyl peptidase 4 interacts with porcine coronavirus PHEV spikes and mediates host range expansion. Journal of Virology, 2024. Vol. 98. №7. e00753-24. DOI: https://doi.org/10.1128/jvi.00753-24.
8. Abbott C.A., Baker E., Sutherland G.R., McCaughan G.W. Genomic organization, exact localization, and tissue expression of the human CD26 (dipeptidyl peptidase IV) gene. Immunogenetics, 1994. Vol. 40. №5. P. 331–338. DOI: https://doi.org/10.1007/BF01246674.
9. Hulswit R.J.G. et al. Human coronaviruses OC43 and HKU1 bind to 9-O-acetylated sialic acids via a conserved receptor-binding site in spike protein domain A. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2019. Vol. 116. №7. P. 2681–2690. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.1809667116.
10. He W.-T., Li D., Baele G., Zhao J., Jiang Z., Ji X., Veit M., Suchard M.A., Holmes E.C., Lemey P., Boni M.F., Su S. Newly identified lineages of porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus exhibit respiratory phenotype. Virus Evolution, 2023. Vol. 9. №2. vead051. DOI: https://doi.org/10.1093/ve/vead051.
11. Greig A.S., Mitchell D., Corner A.H., Bannister G.L., Meads E.B., Julian R.J. A hemagglutinating virus producing encephalomyelitis in baby pigs. Canadian Journal of Comparative Medicine and Veterinary Science, 1962. Vol. 26. №3. P. 49–56. PMID: 17649356.
12. Callebaut P.E. Characteristics of a coronavirus causing vomiting and wasting in pigs. Springer-Verlag, 1974.
13. Turlewicz-Podbielska H., Pomorska-Mól M. Porcine coronaviruses: Overview of the state of the art. Virus Research, 2021. Vol. 308. 198627. DOI: https://doi.org/10.1007/s12250-021-00364-0.
14. Lorbach J.N. et al. Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus and respiratory disease in exhibition swine, Michigan, USA, 2015. Emerging Infectious Diseases, 2017. Vol. 23. №7. DOI: https://doi.org/10.3201/eid2307.170019.
15. Quiroga M.A. et al. Hemagglutinating encephalomyelitis coronavirus infection in pigs, Argentina. Emerging Infectious Diseases. https://www.cdc.gov/eid.

Скачайте в формате .pdf >>>