В 2025 году журналу
ИСПОЛНИЛОСЬ
95 ЛЕТ!

ЧИТАЙТЕ
Материалы к юбилею >>>

РУБРИКИ

Творчество
наших читателей

ЧИТАЙТЕ
Автор С.И. КАЛИНИЧЕНКО
ГИМН СВИНЬЕ >>>

DOI: 10.37925/0039-713X-2025-7-8-69-72
УДК 619:614.91:635.4
КООПЕРАТИВНЫЙ АНТАГОНИЗМ ИЗОЛЯТОВ E.COLI У СВИНЕЙ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ЭНРОФЛОКСАЦИНА

А.Д. СУМАРОКОВА², мл. научный сотрудник сектора лаборатории молекулярной биологии, e-mail: stasaaan@gmail.com, В.Н. АФОНЮШКИН^1,2,3, кандидат биолог. наук, зав. сектором лаборатории молекулярной биологии, e-mail: lisocim@mail.ru, Т.Е. МИРОНОВА², мл. научный сотрудник сектора лаборатории молекулярной биологии, e-mail: mironova.tanya1994@mail.ru, В.С. ЧЕРЕПУШКИНА², мл. научный сотрудник сектора лаборатории молекулярной биологии, e-mail: vicky88@bk.ru, А.М. ПАНИХИНА³, лаборант, e-mail: annamaria20072004@gmail.com, У.А. АРХИПОВА⁴, кандидат биолог. наук, научный консультант, e-mail: uliana.komor@gmail.com, ¹ФГБОУ «Новосибирский государственный аграрный университет», ²ФГБУН «Сибирский федеральный научный центр агробиотехнологий РАН» (п. Краснообск, Новосибирская обл.), ³Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск), ⁴ООО «Алекрис-консалтинг» (п. Краснообск)

Изучена антагонистическая активность различных штаммов E.coli в отношении друг друга после активации образования колицинов с помощью энрофлоксацина. Субтоксические концентрации энрофлоксацина были способны колицино-опосредованно подавлять рост E.coli как посредством внутривидового антагонизма, так и в процессе гибели клеток аутологичного штамма-продуцента. Широкое биоразнообразие штаммов кишечной палочки в микрофлоре свиней может обеспечивать кооперативный антагонизм в отношении экзогенных штаммов кишечной палочки.

Ключевые слова: колицины, антагонизм, энрофлоксацин, Escherichia coli.

Cooperative antagonism of pig E.coli isolates exposed to enrofloxacin

A.D. SUMAROKOVA², junior researcher at the laboratory of molecular biology, e-mail: stasaaan@gmail.com, V.N. AFONYUSHKIN^1,2,3, candidate of biological sciences, head of the laboratory of molecular biology, e-mail: lisocim@mail.ru, T.E. MIRONOVA², junior researcher at the laboratory of molecular biology, e-mail: mironova.tanya1994@mail.ru, V.S. CHEREPUSHKINA², junior researcher at the laboratory of molecular biology, e-mail: vicky88@bk.ru, A.M. PANIKHINA³, laboratory assistant, e-mail: annamaria20072004@gmail.com, U.A. ARKHIPOVA⁴, candidate of biological sciences, scientific consultant, ¹Novosibirsk State Agrarian University, ²Siberian Federal Center of Agrobiotechnologies RAS (Krasnoobsk, Novosibirsk region), ³Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine SB RAS (Novosibirsk), ⁴Alekris-Consulting LLC (Krasnoobsk)

We have studied the antagonistic activity of various E.coli strains against each other after the activation of colicin formation using enrofloxacin. Subtoxic concentrations of enrofloxacin were able to suppress the growth of E.coli through colicin-mediated mechanisms, both via intraspecific antagonism and during the death of cells of the autologous producer strain. The wide biodiversity of E.coli strains in the pig microflora can provide cooperative antagonism against exogenous E.coli strains.

Key words: colicins, antagonism, enrofloxacin, Escherichia coli.

Введение

Бактериальные инфекции представляют актуальную проблему для здравоохранения, санитарно-эпидемиологического и ветеринарного надзора в большинстве стран мира. Это связано с высоким уровнем заболеваемости и отсутствием предпосылок к его сокращению, обусловленных появлением устойчивых к антибиотикам штаммов.

Escherichia coli является бактерией, встречающейся в пище, кормах, кишечнике людей и животных. В то время как многие штаммы являются безопасными, некоторые патогенные штаммы E.coli вызывают тяжелые заболевания и диарею, а также могут провоцировать заболевания вне пищеварительного тракта. Например, энтеротоксигенная E.coli (ETEC) вызывает диарею, дегидратацию, истощение и смерть. ETEC является основной причиной заболеваний новорожденных и только отлученных от свиноматки поросят и передается через загрязненную воду, корм или посредством контакта с животными или людьми. Этот патоген может оказывать огромное влияние на продуктивность свиней – до 25% падежа поросят, уменьшение темпов прироста, а также увеличение расходов на ветеринарные препараты [3, 13, 14].

Колицины ‒ высокоспецифичные антимикробные белки, продуцируемые энтеробактериями в условиях стресса, вызванного нехваткой питательных веществ, перенаселенностью или повреждением ДНК – SOS-ответ, подавляют жизнедеятельность бактерий того же вида или родственных [1, 8, 12].

Для лечения и профилактики эшерихиозов и других родственных бактериальных инфекций представляется целесообразным изучение отдаленных последствий применения некоторых антибиотиков при активации выработки колицинов кишечной микрофлорой.

Цель исследования ‒ изучить роль энрофлоксацин-индуцированного колицинообразования у индигенных изолятов кишечной палочки свиней в отношении друг друга и экзогенных изолятов.

Материалы и методы

Исследования проводили на базе сектора молекулярной биологии Сибирского федерального научного центра агробиотехнологий РАН и лаборатории фармакогеномики ИХБФМ СО РАН.

Материалом служили фекалии, которые отбирали на двух свинокомплексах от клинически здоровых поросят на доращивании. При единичных случаях падежа с признаками эшерихиоза проводили патологоанатомическое вскрытие, культуры выделяли из паренхиматозных органов (сердце, печень). Свинокомплексы характеризовались наличием эшерихиозов, смертность на них не превышала нормативных показателей. Также в работе использовали изоляты E.coli, выделенные из паренхиматозных органов и кишечника цыплят-бройлеров.

Первичное выделение чистых культур проводили на среде Эндо с пересевом на SDS-бульон. Для верификации проверяли наличие глюкуронидазной активности на хромогенном агаре UriSelect 4 (Merk).

Предварительно были исключены генетически идентичные изоляты методами VNTR-типирования (с использованием видоспецифичных праймеров) и ERIC-PCR (табл. 1).

Таблица 1. Список изолятов и источников их получения

Эксперименты по оценке антагонистической активности бактерий E.coli проводили на основе оригинальной модификации метода пересекающихся штрихов [4].

Отличительная особенность предложенного способа состоит в предварительном выращивании штаммов бактерий в виде штрихов на нитроцеллюлозной мембране с размером пор 0,2 мкм (ООО «Владисарт»). Мембрану помещали на агар эугоник с 10%-ным энрофлоксацином в дозе 0,15 мкг/мл, затем на верхнюю часть мембраны проводили посевы параллельными штрихами разных культур (изолятов) кишечной палочки на расстоянии не менее 1 см друг от друга (рис. 1, этап №1).

После культивирования в течение 24‒48 часов при стрессовом воздействии энрофлоксацина (диффузия колицинов) мембрану снимали, а в направлении, поперечном штрихам на мембране, производили посев тест-штаммов, предварительно выращенных в жидкой питательной среде, равномерными штрихами бактериологической петлей или специальным шпателем. Расстояние между культурами должно быть не менее 0,5 см. Чашки с культурами инкубировали 18‒24 часа в термостате при 37^оС (рис. 1, этап №2).

Интерпретация результатов была следующей: подавление роста штамма, снижение плотности штриха – это действие колицинов, индуцируемых SOS-ответом на энрофлоксацин. Как видно на рисунке 1 (этап №3) изолят К3 подавил рост изолятов К1-К3, а изолят К4 ‒ изоляты К1-К5.

Рис. 1. Схема модифицированного метода оценки антагонистической активности бактерий E.coli

Примечание: К – исследуемая культура, 1 ‒ нитроцеллюлозная мембрана, 2 – место расположения мембраны (этап №1 изображен цветами светлее), 3 – результат действия колицинов культур К3 и К4.

Результаты исследования

Была обнаружена антагонистическая активность изолятов №40‒42 (от свиней) в отношении изолятов №33‒36 (от кур), то есть гетерологичных (экзогенных) по происхождению (фото). Спектр активности колицинов у разных изолятов кишечной палочки свиней различался. Например, изолят №42 оказывал бактерицидное действие в отношении трех изолятов кишечной палочки, выделенных от кур. Изоляты №40 и №41 дополняли друг друга, подавляя разные штаммы кишечной палочки от кур, при этом обладали как бактерицидным действием, так и бактериостатическим (снижение плотности штриха).

Фото. Исследование чувствительности изолятов E.coli №32‒36 (от птицы) в отношении экзогенных штаммов-продуцентов E.coli №40‒44 (от свиней)

Было выявлено, что выделение колицинов кишечной палочкой и их активность на определенные штаммы носит индуцибельный характер, то есть спонтанное колицинообразование могло реализовываться довольно редко и энрофлоксацин в субингибирующих концентрациях оказался одним из наиболее стабильных активаторов колициногении. Также встречалась аутогенная активность под действием энрофлоксацина у изолятов №53‒54 (табл. 2).

Таблица 2. Антагонистическая активность с индигенными изолятами E.coli №52‒56 от свиней

Примечание: ± ‒ реакция в виде сниженной плотности штриха культуры (бактериостатический эффект), + ‒ действие колицинов, тест-изолят не вырастает (бактерицидный эффект), - ‒ нет реакции, тест-изолят вырастает.

На основании экспериментальных данных был построен граф взаимодействий разных аутохтонных штаммов кишечной палочки (рис. 2). Ориентация графа с помощью силового алгоритма вывела в крайние точки штаммы, испытывающие минимальные повреждения от антагонистической активности всей совокупности анализируемых изолятов. На основе построенной модели использование субтоксических концентраций энрофлоксацина может привести к сужению биоразнообразия кишечного микробиоценоза за счет элиминации штамма №53, и особенно штамма №52, колицины которого подавляют все остальные изоляты. Культуры №53 и №54 взаимно антагонистичны, но подавление изолята №54 штаммами №52 и №55 создает условия для выживания штамма №53, единственно способного составить конкуренцию изоляту №52.

Рис. 2. Ориентированный граф антагонистических взаимодействий пяти штаммов кишечной палочки микробиоценоза свиньи

Обсуждение

Парадокс систем колицинов (бактериоцинов) кишечной палочки состоит в следующем: спектр активности этих белков очень узок, разнообразие весьма велико и шанс, что при обострившейся внутривидовой конкуренции начавшая продуцировать колицин кишечная палочка подавит именно основного конкурента, кажется призрачным.

В то же время данный клинический опыт показывает: неудачное подавление апатогенной кишечной палочки может привести к вспышке эшерихиозов. Как колифлора желудочно-кишечного тракта саморегулирует штаммовое разнообразие и численность, остается загадкой. Очевидно, что антагонизм кишечной палочки носит кооперативный характер [11].

Важный момент активации синтеза колицинов состоит в стрессовом воздействии на кишечную палочку – например антибиотик, микотоксин или другой колицин [2].

В качестве индуктора-активатора стресса мы выбрали антибиотик из группы фторхинолонов третьего поколения – энрофлоксацин. Известно, что механизм действия данного антибиотика может способствовать индуцированию SOS-ответа у E.coli [5, 8], также была доказана индукция синтеза пороформирующего колицина ColK при субминимальной ингибирующей концентрации ципрофлоксацина и норфлоксацина (фторхинолоны второго поколения) [6, 9].

Индукция колицинов ‒ вариабельный процесс, поэтому результат стрессового воздействия в ряде случаев может пойти по другому, отличному от колициногении пути, – индуцировать эффлюкс или активировать накопление лизогенных бактериофагов [2].

Факт кооперативного антагонизма индигенных изолятов E.coli свиней в отношении экзогенных изолятов от животных другого вида подтверждается результатами исследования (фото). Однако мы можем рассуждать и об аналогичных процессах антагонизма и среди аутохтонных изолятов (табл. 2). Более того, используемая методика позволяет показать колицино-опосредованную активность энрофлоксацина даже касательно аутологичных изолятов кишечной палочки. Последнее утверждение не противоречит данным научной литературы, так как сам процесс образования колицинов часто сопровождается гибелью клеток-продуцентов. Обилие колицинов, образованное штаммом-продуцентом, очевидно, способно создать достаточно высокие концентрации колицинов, подавляющих рост этого же штамма при невысокой плотности посева [7, 9].

Анализ модели взаимодействия штаммов кишечной палочки показывает классическую схему типа «камень, ножницы, бумага» [11]. Под воздействием энрофлоксацина или иных стресс-факторов микробиоценоз выглядит неравновесным и стремящимся сократиться на два компонента. Следствием этого процесса может быть снижение устойчивости кишечной микрофлоры в отношении заноса внешних штаммов, накопление токсигенных штаммов, занявших высвободившуюся экологическую нишу, или уменьшение представленности вирулентного штамма кишечной палочки, в том числе заведомо устойчивого к терапевтическим концентрациям энрофлоксацина.

Заключение

Субтоксические концентрации энрофлоксацина способны колицино-опосредованно подавлять рост E.coli как с помощью внутривидового антагонизма, так и в процессе гибели клеток аутологичного штамма-продуцента.

Широкое биоразнообразие штаммов кишечной палочки в микрофлоре свиней способно обеспечивать кооперативный антагонизм в отношении экзогенных штаммов кишечной палочки.

Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда, проект №24-26-00238, исследование поддержано в рамках государственного задания ИХБФМ СО РАН №125012300671-8

Литература

1. Андреева-Ковалевская Ж.И. и др. Пороформирующие белки и адаптация организмов к условиям окружающей среды. Успехи биологической химии, 2008. Т. 48. №10. С. 267‒318.
2. Афонюшкин В.Н. Постантибиотические реакции SOS-ответа в кишечных микробиоценозах E.coli и их возможные последствия/Афонюшкин В.Н., Кильп А.С., Донченко А.С., Сумарокова А.Д. Ветеринария и кормление, 2025. №1. С. 9‒15. DOI: 10.30917/ATT-VK-1814-9588-2025-1-2.
3. Бригадиров Ю.Н. и др. Комплексная система мероприятий по профилактике и борьбе с респираторными и желудочно-кишечными болезнями свиней в современных условиях производства. Ветеринарная патология, 2012. №1(39). С. 78‒83.
4. Егоров Н.С. Микробы-антагонисты и биологические методы определения антибиотической активности. М.: Высшая школа, 1965. 221 с.
5. Сумарокова А.Д. Изучение влияния комбинаций энрофлоксацина с различными антибиотиками на индукцию SOS-ответа E.coli/А.Д. Сумарокова, Л.Н. Стацевич, В.Н. Штепа, В.Н. Афонюшкин. Ветеринария и кормление, 2023. №7. С. 84‒89.
6. Bano S. et al. Pattern of induction of colicin E9 synthesis by sub MIC of norfloxacin antibiotic. Microbiological Research, 2013. Vol. 168. №10. P. 661‒666.
7. Cascales E. et al. Colicin biology. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2007. Vol. 71. №1. P. 158‒229.
8. Cornforth D.M., Foster K.R. Competition sensing: The social side of bacterial stress responses. Nature Reviews Microbiology, 2013. Vol. 11. №4. P. 285‒293.
9. Jacob F., Siminovitch L., Wollman E. Biosynthesis of a colicin and its mode of action. Annales de l'Institut Pasteur, 1952. Vol. 83. №3. P. 295‒315.
10. Jerman B., Butala M., Zgur-Bertok D. Sublethal concentrations of ciprofloxacin induce bacteriocin synthesis in Escherichia coli. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2005. Vol. 49. №7. P. 3087‒3090.
11. Kirkup B.C., Riley M.A. Antibiotic-mediated antagonism leads to a bacterial game of rock-paper-scissors in vivo. Nature, 2004. Vol. 428. №6981. P. 412‒414.
12. Wang L. et al. Use of bacteriophages to control Escherichia coli O157: H7 in domestic ruminants, meat products, and fruits and vegetables. Foodborne Pathogens and Disease, 2017. Vol. 14. №9. P. 483‒493.
13. Wilson L.A., Sharp P.M. Enterobacterial repetitive intergenic consensus (ERIC) sequences in Escherichia coli: Evolution and implications for ERIC-PCR. Molecular Biology and Evolution, 2006. Vol. 23. №6. P. 1156‒1168.
14. Zhuang C. et al. Escherichia coli infection mediates pyroptosis via activating p53-p21 pathway-regulated apoptosis and cell cycle arrest in bovine mammary epithelial cells. Microbial Pathogenesis, 2023. Vol. 184. P. 106338.

Скачайте в формате .pdf >>>