logo
map
letter
home

Тел.: (495) 988-40-91

Моб. тел.: (916) 721-54-99

В 2020 году журналу
ИСПОЛНИТСЯ
90 ЛЕТ!

РУБРИКИ

Творчество
наших читателей

ЧИТАЙТЕ
Автор С.И. КАЛИНИЧЕНКО
ГИМН СВИНЬЕ >>>

СТАТЬИ ИЗ НОМЕРА

УДК 636.4
РРСС: СРАВНИТЕЛЬНЫЕ ИСПЫТАНИЯ ИФА-ТЕСТОВ ДЛЯ ОБЪЕКТИВНОЙ ДИАГНОСТИКИ

В.В. МИХАЙЛОВА, зав. отделом вирусологии, Т.П. ЛОБОВА, кандидат биолог. наук, ст. научный сотрудник отдела вирусологии, А.Н. СКВОРЦОВА, мл. научный сотрудник отдела вирусологии, М.С. ШИШКИНА, мл. научный сотрудник отдела вирусологии, ФГБУ «Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория»

Рассмотрены проблемы зависимости точности диагностики РРСС от специфичности и чувствительности диагностических наборов. Отмечена важность правильной диагностики для составления плана противоэпизоотических мероприятий. Приведены примеры чувствительности и специфичности разных тестов.

Ключевые слова: РРСС, диагностика, ИФА, специфичность, чувствительность.

PRRS: comparative tests of ELISA tests for objective disgnostics

V.V. MIKHAILOVA, head of the department of virology, T.P. LOBOVA, candidate of biological sciences, senior researcher of virology department, A.N. SKVORTSOVA, junior researcher of virology department, M.S. SHISHKINA, junior researcher of virology department, FSBI Central Scientific and Methodological Veterinary Laboratory

Troubles of dependence of accuracy of diagnostic kit on PRRS from its specificity and sensitivity and the importance of correct diagnostics for planning of antiepizootic measures are observed in this article. Examples of sensitivity and specificity of different tests are shown.

Key words: PRRS, diagnosis, ELISA, specificity, sensitivity.

DOI: 10.37925/0039-713X-2020-5-26-28

 

Репродуктивно-респираторный синдром свиней («синее ухо»), вызываемый вирусом рода Arterivirus, является причиной серьезных экономических потерь во всем мире [1]. Вирус РРСС представляет собой одноцепочечную структуру РНК с высокой генетической изменчивостью и в основном характеризуется репродуктивной недостаточностью у свиноматок и респираторными заболеваниями у свиней всех возрастов. Клинические признаки могут значительно различаться между животными и зависят от вирулентности заражающего штамма [3]. Существуют два основных различающихся по антигенам типа вируса ‒ 1-й тип (европейский) и 2-й тип (североамериканский). Раньше 1-й тип был ограничен территорией Европы, а 2-й тип – Северной Америки, но в настоящее время оба типа распространены по всему миру, а в Азии выделены высокопатогенные штаммы, которые являются сублинией РРСС 2-го типа [4, 5].

Источником возбудителя инфекции являются больные и переболевшие свиньи. Основные пути передачи возбудителя болезни ‒ контакт с инфицированными животными, экскрементами, мочой, семенной жидкостью, скармливание необеззараженных продуктов и сырья, полученного от больных животных, инфицированные предметы ухода, корма, транспортные средства, а также подтверждена возможность передачи на небольшие расстояния посредством насекомых (мух и комаров) и аэрогенным путем.

В настоящее время проблемой широкого распространения репродуктивно-респираторного синдрома свиней является высокая изменчивость вируса. Большое генетическое разнообразие вируса затрудняет разработку лабораторных тест-систем и осложняет оценку уровня защиты свиней от РРСС. Животные могут показывать гомологичную защиту в течение длительного времени ‒ до 600 дней, тем не менее защита от одного штамма РРСС не ограждает от гетерологичных штаммов. Уровень гетерологичной защиты значительно варьируется, и его невозможно предсказать. Таким образом, анализ последовательности (секвенирование) не дает объективной оценки защиты. К тому же, как оказалось, на уровень защиты влияет и геном хозяина.

Также осложняют проблему распространения репродуктивно-респираторного синдрома свиней и условия содержания больших популяций свиней на ограниченном пространстве, невыясненные проблемы путей передачи [6]. Поэтому для постановки достоверного диагноза рекомендуется проводить комплексные исследования несколькими лабораторными методами.

Согласно Приказу Министерства сельского хозяйства Российской Федерации от 24.01.2018 №25 «Об утверждении Ветеринарных правил осуществления профилактических, диагностических, ограничительных и иных мероприятий, установления и отмены карантина и иных ограничений, направленных на предотвращение распространения и ликвидацию очагов репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС)» диагноз считается установленным, если в пробах обнаружен возбудитель, или его генетический материал, или антитела против РРСС, не связанные с вакцинацией. Поэтому в большинстве лабораторий РФ используются такие методы диагностики, как вирусовыделение, ПЦР и ИФА.

На территории России распространенным методом лабораторной диагностики РРСС является ИФА. Несмотря на то что он нетрудоемкий и человеческий фактор сведен к минимуму посредством автоматизированных станций, достоверность полученных результатов зависит от применяемых коммерческих тест-систем и точности иммуноферментных анализаторов. Поэтому перед использованием тест-систем в лабораторной практике необходимо проводить внутрилабораторную оценку чувствительности, специфичности и воспроизводимости. При этом нужно иметь в наличии широкую линейку стандартизированных референтных образцов для проверки тест-набора и тем самым удостовериться в его качестве. Для полноценного анализа также следует учитывать валидационные отчеты, полученные при производстве. Добросовестные разработчики по запросу предоставляют такие данные.

Цель работы ‒ оценка пригодности двух коммерческих тест-систем для определения антител к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней методом ИФА.

Материалы и методы

Были проведены исследования с использованием двух коммерческих тест-систем: №1 ‒ PRRS X3 Ab Test (IDEXX); №2 ‒ другого производителя аналогичных тест-наборов (BioChek). Испытания были произведены и проанализированы в соответствии с инструкцией по применению производителя. Получение и обработка результатов была осуществлена с помощью спектрофотометров, используемых в лаборатории и внесенных в область аккредитации.

В качестве материала для анализа чувствительности использовалась референтная сыворотка PRRSV Serum (VLDIA 243). Эта сыворотка по данным GD оценена как слабоположительная. Обычно такие результаты характерны при исследовании на наличие антител через одну-две недели после инфицирования, когда иммунный ответ только начинает формироваться.

Сертификат соответствия референтной сыворотки VLDIA 243

Для оценки повторяемости данная рефсыворотка исследовалась в 20 повторах. Результаты данных этого исследования приведены в таблице 1.

Стоит отметить, что референтный образец, заявленный GD Animal Health как слабоположительный, в исследуемых тест-системах показал разные результаты, так как, согласно инструкциям к тест-наборам, результат при использовании тест-набора №1 считается положительным при значении S/P-отношения меньше 0,4, а при применении тест-набора №2 ‒ при значении S/P-отношения меньше 0,5.

Таблица 1. Оценка повторяемости.

№1 (IDEXX)

ID пробы

оптимальная плотность

S/P

результат

Отрицательный контроль

0,058

Отрицательный контроль

0,064

Положительный контроль

0,469

Положительный контроль

0,478

VLDIA 243

0,305

0,592

Положительно

VLDIA 243

0,322

0,633

Положительно

VLDIA 243

0,326

0,642

Положительно

VLDIA 243

0,330

0,652

Положительно

VLDIA 243

0,407

0,839

Положительно

VLDIA 243

0,333

0,659

Положительно

VLDIA 243

0,333

0,659

Положительно

VLDIA 243

0,323

0,635

Положительно

VLDIA 243

0,339

0,674

Положительно

VLDIA 243

0,349

0,698

Положительно

VLDIA 243

0,376

0,764

Положительно

VLDIA 243

0,369

0,747

Положительно

VLDIA 243

0,365

0,737

Положительно

VLDIA 243

0,355

0,713

Положительно

VLDIA 243

0,360

0,725

Положительно

VLDIA 243

0,348

0,696

Положительно

VLDIA 243

0,361

0,727

Положительно

VLDIA 243

0,347

0,693

Положительно

VLDIA 243

0,348

0,696

Положительно

VLDIA 243

0,348

0,696

Положительно

CV%

7,70

 

№2 (BioChek)

ID пробы

оптимальная плотность

S/P

результат

Отрицательный контроль

0,139

Отрицательный контроль

0,141

Положительный контроль

1,090

Положительный контроль

1,040

VLDIA 243

0,374

0,253

Отрицательно

VLDIA 243

0,414

0,296

Отрицательно

VLDIA 243

0,369

0,248

Отрицательно

VLDIA 243

0,384

0,264

Отрицательно

VLDIA 243

0,347

0,224

Отрицательно

VLDIA 243

0,382

0,262

Отрицательно

VLDIA 243

0,384

0,264

Отрицательно

VLDIA 243

0,388

0,268

Отрицательно

VLDIA 243

0,395

0,276

Отрицательно

VLDIA 243

0,393

0,274

Отрицательно

VLDIA 243

0,343

0,219

Отрицательно

VLDIA 243

0,398

0,279

Отрицательно

VLDIA 243

0,368

0,246

Отрицательно

VLDIA 243

0,389

0,269

Отрицательно

VLDIA 243

0,390

0,270

Отрицательно

VLDIA 243

0,388

0,268

Отрицательно

VLDIA 243

0,415

0,297

Отрицательно

VLDIA 243

0,381

0,261

Отрицательно

VLDIA 243

0,383

0,263

Отрицательно

VLDIA 243

0,358

0,236

Отрицательно

CV%

8,00

При оценке коэффициента вариации (сходимости результатов) нужно обратить внимание на то, что чем больше значение CV%, тем относительно больший разброс и, соответственно, меньшая однородность значения S/P. Если коэффициент вариации меньше 10%, то изменчивость вариационного ряда принято считать незначительной. Из таблицы 1 можно сделать вывод о том, что в двух исследуемых тест-системах коэффициент вариации меньше 10%, при этом тест-система №2 имеет значения немного выше, чем тест-система №1.

Также были проведены сравнительные исследования группы проб, которые состоят из шести полевых сывороток крови, полученных из разных свиноводческих хозяйств путем случайной выборки. Данные пробы исследовались параллельно в одинаковых условиях.

Таблица 2. Исследования полевых образцов

Полевой образец

№1 (IDEXX)

№2 (BioChek)

проба

оптимальная плотность

S/P

результат

оптимальная плотность

S/P

результат

Отрицательный контроль

0,058

0,139

Отрицательный контроль

0,064

0,141

Положительный контроль

0,469

1,09

Положительный контроль

0,478

1,04

1-я

0,321

0,630

Положительно

0,490

0,378

Отрицательно

2-я

0,903

2,041

Положительно

1,367

1,326

Положительно

3-я

0,963

2,187

Положительно

2,681

2,747

Положительно

4-я

0,284

0,541

Положительно

0,315

0,189

Отрицательно

5-я

0,722

1,602

Положительно

1,239

1,188

Положительно

6-я

0,850

1,913

Положительно

2,821

2,898

Положительно

Средний титр

1,486

1,454

CV%

44,5

84

Из данных, представленных в таблице 2, видно, что некоторые образцы продемонстрировали положительный результат в обоих тест-наборах (пробы №2, №3, №5, №6), но образцы №1 и №4 показали значительные расхождения: исследованные на тест-наборе №1 оценены как положительные, а на тест-наборе №2 – как отрицательные.

Чувствительность тест-систем по РРСС играет определяющую роль в системе современных мер контроля и предотвращения распространения РРСС. Ведь в первую очередь необходимо контролировать племенных животных – ремонтных и основных свинок и хряков как основной фактор распространения болезни, а также завозимых в хозяйство. Поэтому лаборатории должны использовать наиболее чувствительные тест-системы ИФА, чтобы не допустить заноса инфекции. Чувствительность тест-системы также позволит наиболее точно оценить своевременность и эффективность вакцинации и заблаговременно предупредить о вероятности обострения эпизоотии при ее латентной форме.

Литература

  1. Zimmerman J.J., Benfield D.A., Murtaugh M.P., Osorio F., Stevenson G.W., Torremorell M. Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus. In Diseases of swine. 9th edition. Edited by Straw B.E., Zimmerman J.J., D’Allaire S., Taylor D.J. Ames, Iowa: Blackwell Science, 2006. Р. 387–417.
  2. Гусев А.А., Пунтус И.А., Бабак В.А. Репродуктивно-респираторный синдром свиней: меры специфической профилактики. Материалы Международного агробиотехнологического симпозиума, посвященного 80-летию члена-корреспондента РАН, заслуженного деятеля науки РФ Сочнева В.В., 2016.
  3. Stadejek T., Stankevicius A., Murtaugh M.P., Oleksiewicz M.B. Molecular evolution of PRRSV in Europe: current state of play. Vet. Microbiol., 2013. 165:21‒28. 10.1016/j.vetmic.2013.02.029.
  4. Дудников С.А. Количественная эпизоотология: основы эпидемиологии и биостатистики. Владимир, 2004. 460 с.
  5. Nguyen T.D.T., Nguyen T.T., Nguyen G.S., Le T.T.H., Vo K.H., Nguyen T.N., Do V.A.K. Genetic analysis of ORF5 Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus isolated in Vietnam. Microbiol. Immunol., 2013. 57:518‒526.
  6. Ануфриев П.А., Паршин П.А., Сулейманов С.М. Клинико-эпизоотологическая и патоморфологическая диагностика репродуктивно-респираторного синдрома свиней. Вестник Российского университета дружбы народов: Агрономия и животноводство, 2009. №3. С. 74‒80.

 

Скачайте в формате .pdf >>>

вверх