В 2025 году журналу
ИСПОЛНИТСЯ
95 ЛЕТ!

ЧИТАЙТЕ
Материалы к юбилею >>>

РУБРИКИ

Творчество
наших читателей

ЧИТАЙТЕ
Автор С.И. КАЛИНИЧЕНКО
ГИМН СВИНЬЕ >>>

DOI: 10.37925/0039-713X-2025-5-51-56
УДК 636.018:636.4:575.162
ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ SUS SCROFA: РАЗРАБОТКА УНИВЕРСАЛЬНОЙ СИСТЕМЫ АНАЛИЗА D-ПЕТЛИ МТДНК В СОВРЕМЕННЫХ И ИСТОРИЧЕСКИХ ОБРАЗЦАХ

А.М. ЦЫБ, мл. научный сотрудник, Н.Ф. БАКОЕВ, кандидат с.-х. наук, М.С. ФОРНАРА, кандидат биолог. наук, Р.Ю. ЧИНАРОВ, кандидат вет. наук, Н.А. ЧУРБАКОВА, мл. научный сотрудник, В.Р. ХАРЗИНОВА, кандидат биолог. наук, О.И. БОРОНЕЦКАЯ, кандидат с.-х. наук, директор Музея животноводства имени Е.Ф. Лискуна, РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева, Н.А. ЗИНОВЬЕВА, доктор биолог. наук, академик РАН, ФГБНУ ФИЦ ВИЖ имени Л.К. Эрнста

Домашняя свинья (Sus scrofa domesticus), произошедшая от дикого кабана (Sus scrofa linnaeus, 1758), была одомашнена около 9000-10 000 лет назад и с тех пор играет ключевую роль в обеспечении человечества мясной продукцией. Однако, несмотря на длительную историю доместикации и широкое распространение, многие аспекты генетического разнообразия современных и исторических популяций свиней остаются недостаточно изученными. Целью данной работы явился анализ полиморфизма D-петли митохондриальной ДНК (мтДНК) у исторических и современных представителей Sus scrofa (домашних свиней и дикого кабана) посредством разработки универсальной тест-системы амплификации D-петли мтДНК для характеристики генетического разнообразия исследуемых видов, установления филогенетических связей, определения гаплогрупповой принадлежности и проведения сравнительного анализа исторических и современных образцов пород свиней и дикого кабана. Биологическим материалом для проведения исследований служили 86 образцов, включая исторические (конец XIX – первая половина XX века) и современные породы (крупная белая, муромская, уржумская), а также диких кабанов. Разработанная в ходе исследования тест-система на основе трех пар специфических праймеров показала высокую эффективность для анализа полиморфизма D-петли мтДНК, позволившая успешно амплифицировать целевой фрагмент длиной 705 п.н. как в современных, так и в исторических образцах, включая музейные экспонаты конца XIX - первой половины XX века. Последующее секвенирование выявило 39 полиморфных сайтов, формирующих 40 различных гаплотипов. Филогенетический анализ показал, что 72,5% гаплотипов относятся к европейским гаплогруппам (D, E), а 27,5% – к азиатским (A, C). Особый интерес представили результаты сравнительного анализа. Так, исторические образцы крупной белой (HD=0,962) и уржумской (HD=1,000) пород показали более высокое гаплотипическое разнообразие по сравнению с современными аналогами (HD=0,905 и 0,895 соответственно). При этом обратная тенденция отмечена в популяции свиней муромской породы. Образцы диких кабанов продемонстрировали максимальное генетическое разнообразие (HD=1,000). Полученные нами данные свидетельствуют о существенных изменениях генетической структуры исследованных пород свиней за последнее столетие, вероятно связанных с интенсивной селекционной работой и сужением генетического разнообразия в современных породах. Разработанная тест-система не только позволила определить гаплогрупповую принадлежность, но и предоставила возможность исследования процессов эволюции и формирования пород в рамках вида Sus scrofa. Полученные данные могут быть использованы для реконструкции истории одомашнивания свиней в России, оптимизации селекционных программ и сохранения генетического разнообразия.

Ключевые слова: Sus scrofa, D-петля, митохондриальная ДНК, гаплогруппы, исторические образцы.

Genetic diversity of Sus scrofa: Development of a universal analysis system for the D-loop of mtDNA in modern and historical samples

A.M. TSYB, junior researcher, N.F. BAKOEV, candidate of agricultural sciences, M.S. FORNARA, candidate of biological sciences, R.Yu. CHINAROV, candidate of veterinary sciences, N.A. CHURBAKOVA, junior researcher, V.R. KHARZINOVA, candidate of biological sciences, O.I. BORONETSKAYA, candidate of agricultural sciences, director of the E.F. Liskun Museum of Animal Husbandry, Russian State Agrarian University – Moscow Timiryazev Agricultural Academy, N.A. ZINOVIEVA, doctor of biological sciences, academician of the RAS, Federal Research Center for Animal Husbandry named academician L.K. Ernst

Domestic pig (Sus scrofa domesticus), descended from the wild boar (Sus scrofa linnaeus, 1758), was domesticated about 9,000 to 10,000 years ago and has since played a key role in providing meat products for humanity. However, despite the long history of domestication and widespread distribution, many aspects of the genetic diversity of modern and historical pig populations remain underexplored. The aim of this work was to analyze the polymorphism of the D-loop of mitochondrial DNA (mtDNA) in historical and modern representatives of Sus scrofa (domestic pigs and wild boars) by developing a universal test system for the amplification of the mtDNA D-loop to characterize the genetic diversity of the studied species, establish phylogenetic relationships, determine haplogroup affiliation, and conduct a comparative analysis of historical and modern samples of pig breeds and wild boars. The biological material for the research consisted of 86 samples, including historical (late 19th – first half of the 20th century) and modern breeds (Large White, Murom, Urzhum), as well as wild boars. The test system developed during the study, based on three pairs of specific primers, showed high effectiveness for analyzing the polymorphism of the D-loop of mtDNA, successfully amplifying the target fragment of 705 bp in both modern and historical samples, including museum specimens from the late 19th - first half of the 20th century. Subsequent sequencing revealed 39 polymorphic sites, forming 40 different haplotypes. Phylogenetic analysis showed that 72.5% of haplotypes belong to European haplogroups (D, E), while 27.5% belong to Asian (A, C). The results of the comparative analysis were of particular interest. Thus, the historical samples of Large White (HD=0.962) and Urzhum breeds (HD=1.000) showed higher haplotypic diversity compared to modern counterparts (HD=0.905 and 0.895, respectively). An inverse trend was noted in the population of Murov pigs. Samples of wild boars demonstrated maximum genetic diversity (HD=1.000). The data we obtained indicate significant changes in the genetic structure of the studied pig breeds over the last century, likely associated with intensive breeding work and narrowing genetic diversity in modern breeds. The developed test system not only allowed for the determination of haplogroup affiliation but also provided the opportunity to study evolutionary processes and breed formation within the species Sus scrofa. The obtained data can be used to reconstruct the history of pig domestication in Russia, optimize breeding programs, and preserve genetic diversity.

Key words: Sus scrofa, D-loop, mitochondrial DNA, haplogroups, historical samples.

Введение

Sus scrofa (linnaeus, 1758) – кабан, крупное парнокопытное млекопитающее, одомашненное около 9 000-10 000 тыс. лет назад. Этот вид сельскохозяйственных животных широко распространен на территории России и является экономически значимым объектом [1].

По данным Росстата, в 2024 году производство свинины составило 4 млн 601 тыс. т в убойном весе. По статистике производства различных видов мяса, около половины (45,7%) приходится на птицу, свыше трети (38,51%) ‒ на свинину, объем говядины ‒ 14,04%, а баранины и козлятины – 1,75%. Общая численность поголовья свиней в хозяйствах составляет 27,8 млн голов. Наиболее распространенными породами являются крупная белая, йоркшир, ландрас, дюрок [2].

Для эффективного ведения сельскохозяйственных отраслей необходимо грамотно задействовать природный производственный потенциал. Это невозможно без понимания протекающих генетических процессов, которые происходят внутри каждого представителя различных пород, разводимых на территории России [3].

Анализ животных на генетическом уровне позволяет оценить их разнообразие и изменчивость, что является опорой для направления ведения селекционной работы.

Сегодня развивающиеся методы генотипирования способствуют выявлению генетического разнообразия как одного гена, так и целого генома. Вне зависимости от экспрессии генов молекулярные маркеры способны представлять информацию о каждом регионе генома [4]. Первые исследования митохондриальной ДНК позволили изучить эволюцию происхождения видов и их расселение по всем континентам.

Митохондриальная ДНК имеет цитоплазматический тип наследования, то есть генетическая информация наследуется по материнской линии, что делает этот маркер уникальным. Митохондриальный геном представлен в клетке несколькими тысячами копий, его длина ‒ до 17 000 п.н. (в зависимости от вида). Благодаря такому количеству копий именно мтДНК служит основным источником генетической информации ископаемых останков, в которых ДНК дегенеративно.

Изучение генетической структуры исторических образов свиней охватывает широкий спектр научных и практических задач, которые направлены на улучшение продуктивных показателей отрасли, а также на сохранение биоразнообразия. Включение в исследование исторических образцов свиней позволяет реконструировать эволюцию и демографическую историю формирования пород домашней свиньи Sus scrofa domesticus [5]. У вида Sus scrofa мтДНК имеет 16 613 п.н., в структуре которой присутствует 13 генов, кодирующих белок, два гена рибосомальной РНК, 22 гена трансферной РНК и некодирующий контрольный регион (D-петля).

D-петля ‒ некодирующий контрольный участок мтДНК. Этот участок активно используется в изучении происхождения животных, их классификации и идентификации связей между популяциями [6]. Анализ D-петли мтДНК свиней позволил выявить пять гаплогрупп, три из которых имеют азиатское происхождение (A, B, C), а оставшиеся две – европейское (D, E) [7].

Целью работы явился анализ полиморфизма D-петли митохондриальной ДНК у исторических и современных представителей Sus scrofa (домашних свиней и дикого кабана) посредством разработки универсальной тест-системы амплификации D-петли мтДНК для характеристики генетического разнообразия исследуемых видов, установления филогенетических связей, определения гаплогрупповой принадлежности и проведения сравнительного анализа исторических и современных образцов пород свиней и дикого кабана.

Материалы и методы

Биологическим материалом для проведения исследований митохондриальной ДНК послужили образцы 86 свиней, из них 23 исторических образца пород свиней крупная белая (n=15), уржумская (n=4) и муромская (n=4) и 60 образцов современных пород свиней: крупная белая (n=20), уржумская (n=20) и муромская (n=20), а также три образца диких кабанов из Омской (n=2) и Тюменской (n=1) областей.

Исторические образцы были получены из музейных экспонатов черепов свиней, датированных концом XIX ‒ первой половиной XX века, хранящихся в краниологической коллекции Музея животноводства имени Е.Ф. Лискуна (РГАУ ‒ МСХА имени К.А. Тимирязева). Образцы современных пород свиней и кабанов были получены из УНУ «Банк генетического материала домашних и диких видов животных и птицы» в составе сетевой биоресурсной коллекции сБРК СХЖ (соглашение с Минобрнауки России № 075-15-2021-1037 от 28 сентября 2021 г.) созданной и поддерживаемой в ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. Л.К. Эрнста. Исследование проводили с использованием оборудования и материалов центра коллективного пользования «Биоресурсы и биоинженерия сельскохозяйственных животных» ФГБНУ ФИЦ ВИЖ имени Л.К. Эрнста.

Выделение ДНК проводилось с использованием набора COrDIS «Экстракт» (ООО «Гордиз», Россия) в соответствии с рекомендациями производителя. Для амплификации области D-петли мтДНК исторических образцов свиней были подобраны три перекрывающих друг друга пары праймеров. Общая длина составила 1056 п.н. между позициями 20‒1076 мтДНК. Праймеры были подобраны на основе референсной последовательности мтДНК свиней, представленной в базе Национального центра биотехнологической информации NCBI (GenBank: NC_000845.1) с помощью онлайн-ресурса Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (табл. 1).

Таблица 1. Последовательность праймеров для амплификации D-петли мтДНК исторической ДНК свиней

ПЦР амплификацию проводили на термоциклере Applied Biosystems SimpliAmp (Thermo-Fisher Scientific, Inc., США) в конечном объеме 25 мкл, в том числе 2,5 мкл реакционного буфера (10X Taq Turbo буфер) («Евроген» Россия), 16,8 мкл H2O, 2,5 мкл dNTPs, 1 мкл смеси праймеров 10 пмоль, 0,2 мкл SmartTaq ДНК полимеразы («Диалат Лтд.», Россия), 1 мкл ДНК. Условия температурно-временного режима ПЦР были следующими: начальная денатурация (95°С в течение 3 минут); 95°С в течение 8 секунд, 62°С в течение 12 секунд, 72°С в течение 45 секунд (40 цикла); заключительная элонгация (72°С в течение 8 минут).

Для определения температурного режима отжига праймеров проводили градиентный-ПЦР. Детекцию результатов ПЦР выполняли в 2%-ном агарозном геле с использованием колориметрической системы документации на геле Uvitec FireReader V10 imaging System (Cleaver scientific, Великобритания) (рис. 1, 2).

Рис. 1. Электрофореграмма результатов ПЦР-градиента в 2%-ном агарозном геле первой, второй и третьей пары праймеров

Рис. 2. Электрофореграмма результатов ПЦР D-петли мтДНК исторических и современных образцов, состоящая из трех пар праймеров, в 2%-ном агарозном геле

Очистка ампликонов осуществлялась с помощью набора для очистки ДНК из реакционной смеси и агарозного геля Cleanup-Mini («Евроген»). Секвенирование выполнено методом Сэнгера на приборе «Нанафор» 05 («Синтол», Россия). Выравнивание результатов секвенирования выполняли на основе полной последовательности мтДНК (GenBank: CM009106.1) с использованием программ BioEdit 7.2. [8]. Расчеты и построение филогенетического дерева осуществляли методом максимального правдоподобия в программе MEGA X [9]. Для определения генетического разнообразия и выявления гаплотипов использовали программу DnaSP 6 [10].

Для определения принадлежности исследуемых исторических образцов свиней к известным гаплогруппам из базы NCBI были отобраны последовательности мтДНК, относящиеся к гаплогруппам A, B, C, D, E. В качестве внешней группы использовали последовательности D-петли мтДНК африканского бородавочника (табл. 2).

Таблица 2. Известные гаплогруппы свиней и внешняя группа

Результаты исследования

Результаты секвенирования ампликонов, полученных с помощью трех пар праймеров, были выравнены на основе референсной последовательности GenBank: CM009106.1 и соединены между собой (рис. 3).

Рис. 3. Результаты выравнивания последовательности секвенирования (фрагменты первой, второй и третьей пары праймеров)

Общая длина нуклеотидной последовательности исследуемых образцов составила 705 п.н., что позволило получить основную часть от 105 нуклеотида по 805 нуклеотид D-петли мтДНК исторических и современных образцов свиней.

На основании полученных сиквенсных (n=86) фрагментов D-петли мтДНК у исторических свиней всего было выявлено 39 полиморфных сайтов и 40 гаплотипов. Гаплотипическое разнообразие составило 0,964, количество нуклеотидных замен на сайт составило 5,621 и нуклеотидное разнообразие 0,00797 (табл. 3).

Таблица 3. Генетическое разнообразие свиней

Примечание. Здесь и далее: LW ‒ крупная белая порода, MUR ‒ муромская порода, URZ ‒ уржумская порода, LWHST ‒ исторический образец крупной белой породы, MURHST ‒ исторический образец муромской породы, URZHST ‒ исторический образец уржумской породы, WLDB ‒ образцы дикого кабана; n ‒ количество голов, s ‒ количество полиморфных сайтов, h ‒ гаплотипы, HD ‒ разнообразие гаплотипов, k ‒ количество нуклеотидных замен на сайт, π ‒ разнообразие нуклеотидов.

Крупная белая порода исторических образцов имела большее гаплотипическое разнообразие по сравнению с современной крупной белой породой (HD=0,962)/(HD=0,905) соответственно. Количество полиморфных сайтов, количество нуклеотидных замен на сайт и нуклеотидное разнообразие было больше у современных пород по сравнению с историческими свиньями крупной белой породы (s=24/20), (k=10,089/4,686), (π=0,01431/0,00665) соответственно.

Муромская порода на основе современных образцов по сравнению с историческими показала большее гаплотипическое разнообразие (HD=0,800/0,500), количество полиморфных сайтов (s=5/1), количество нуклеотидных замен на сайт (k=1,284/0,500) и нуклеотидное разнообразие (π=0,01431/0,00071) соответственно.

По уржумской породе на основе исторических образцов, относительно современных, определено большее гаплотипическое разнообразие (HD=1,000/0,895), количество полиморфных сайтов (s=22/5), нуклеотидных замен на сайт (k=11,500/1,653) и нуклеотидное разнообразие (π=0,01631/0,01631) соответственно.

Несмотря на небольшое количество голов, в группе кабанов определено большое генетическое разнообразие: 21 полиморфный сайт; 1,0 гаплотипическое разнообразие (HD=1,000); 14,0 нуклеотидных замен на сайт и 0,00207 нуклеотидное разнообразие.

Всего было выявлено 40 гаплотипов, полиморфные сайты гаплотипов представлены на рисунке 4.

Рис. 4. Позиции полиморфных сайтов, определяющих 40 гаплотипов у исторических и современных свиней

Распределение гаплотипов выявило, что H-6 был общим между современными породами крупной белой, муромской, уржумской и представителями исторических образцов пород крупной белой и уржумской (табл. 4).

Таблица 4. Распределение выявленных гаплотипов по породам

Гаплотип H-12 был общим среди современных пород свиней муромской и уржумской породы и включал 12 голов. Современные представители уржумской породы имели общего предка с историческими представителями муромской породы. Гаплотипы, выявленные у кабанов, не имели общих предков с представителями домашних свиней.

Филогенетическое дерево было построено методом максимального правдоподобия с использованием 40 выявленных гаплотипов, 5 референсных последовательностей известных гаплогрупп A, B, C, D, E и африканского бородавочника (DQ409327.1) в качестве внешней группы. На рисунке 5 представлены все гаплотипы, из которых 72,5% имеют европейское и 27,5% азиатское происхождение.

Рис. 5. Филогенетическое дерево, построенное методом максимального правдоподобия

В азиатской группе гаплотипы H-3, H-4, H-8 и H-9 отошли к гаплогруппе C, гаплотипы H-1, H-2, H-24, H-25, H-35, H-38 и H-39 к гаплогруппе A. Гаплотипов, принадлежавших гаплогруппе B выявлено не было. К гаплогруппам европейского происхождения отошли гаплотипы H-5, H-6, H-12-23, H-26-34, H-37 и H-40 (к гаплогруппе D) и гаплотипы H-7, H-10, H-11 и H-36 (к гаплогруппе E).

Заключение

Таким образом, разработанная нами на основе трех пар праймеров тест-система позволила амплифицировать участок D-петли мтДНК размером 705 п.н. у исторических, современных и диких представителей рода Sus Sus scrofa. Всего было выявлено 39 полиморфных сайтов, приводящих к 40 гаплотипам, на основе которых построено филогенетическое дерево и определена гаплогрупповая принадлежность исследуемых образцов к гаплогруппам рода Sus scrofa A, B, C, D, и E. Данная тест-система не только позволяет получить информацию о гаплогрупповой принадлежности, но и предоставляет возможность изучить процессы эволюции и становления пород в рамках вида Sus scrofa.

Исследования проведены при финансовой поддержке Российского научного фонда в рамках проекта №23-46-00014

Литература

1. Кундик Ю.В. Роль молекулярно-генетических исследований в изучении происхождения домашних свиней/Ю.В. Кундик, С.Л. Сафронов. Вестник Студенческого научного общества, 2018. Т. 9. №1. С. 192‒194.
2. Федеральная служба государственной статистики. URL: https://rosstat.gov.ru.
3. Охохонина Е.Н. Использование ДНК-маркеров в селекции свиней/Е.Н. Охохонина, А.А. Голощапов//Развитие научной, творческой и инновационной деятельности молодежи: Материалы XII Всероссийской (национальной) научно-практической конференции молодых ученых, посвященной 125-летию Т.С. Мальцева/Под общ. ред. И.Н. Миколайчика. Курган: Курганская государственная сельскохозяйственная академия имени Т.С. Мальцева, 2020. С. 253‒259.
4. Воропаева Е.Н., Максимов В.Н., Малютина С.К., Бобак М., Воевода М.И. Обзор свойств и методов исследования митохондриальной ДНК. Journal of Siberian Medical Sciences, 2016. №3.
5. Larson G., Albarella U., Dobney K., Rowley-Conwy P., Schibler J., Tresset A., Vigne J.D., Edwards C.J., Schlumbaum A., Dinu A., Balaçsescu A., Dolman G., Tagliacozzo A., Manaseryan N., Miracle P., Van Wijngaarden-Bakker L., Masseti M., Bradley D.G., Cooper A. Ancient DNA, pig domestication, and the spread of the Neolithic into Europe. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 2007. 104(39):81‒15276. DOI: 10.1073/pnas.0703411104. Epub. 2007. Sep. 13. PMID: 17855556; PMCID: PMC1976408.
6. Okada T., McIlfatrick S., St. John J.C. Mitochondrial DNA deficiency and supplementation in Sus scrofa oocytes influence transcriptome profiles in oocytes and blastocysts. Int. J. Mol. Sci., 2023. 24(4):3783. DOI: 10.3390/ijms24043783.
7. Tsai T.S., Rajasekar S. & St. John J.C. The relationship between mitochondrial DNA haplotype and the reproductive capacity of domestic pigs (Sus scrofa domesticus). BMC Genet., 2016. 17:67. doi.org/10.1186/s12863-016-0375-4.
8. Hall T.A. BioEdit: A user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids. Symp., 1999. 41:95‒98.
9. S. Kumar, G. Stecher, M. Li, C. Knyaz and K. Tamura. MEGA X: Molecular evolutionary genetics analysis across computing platforms. Molecular Biology and Evolution, 2018. 35:1547‒1549. DOI: 10.1093/molbev/msy096.
10. Rozas J., Ferrer-Mata A., Sánchez-DelBarrio J.C., Guirao-Rico S., Librado P., Ramos-Onsins S.E., Sánchez-Gracia A. DnaSP 6: DNA sequence polymorphism analysis of large data sets. Mol. Biol. Evol., 2017. 34(12):3299‒3302. doi.org/10.1093/molbev/msx248.
11. Wu G.S., Yao Y.G., Qu K.X. et al. Population phylogenomic analysis of mitochondrial DNA in wild boars and domestic pigs revealed multiple domestication events in East Asia. Genome Biol., 2007. doi.org/10.1186/gb-2007-8-11-r245.

Скачайте в формате .pdf >>>